序：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售實(shí)驗(yàn)室儀器、設(shè)備及相關(guān)配套裝置于一體的現(xiàn)代科技企業(yè)。公司堅(jiān)持以提升產(chǎn)品應(yīng)用價(jià)值為目標(biāo)，致li于先jin技術(shù)的推廣，通過穩(wěn)定、快速、便捷的銷售網(wǎng)絡(luò)，為用戶提供專業(yè)、便捷、高效、優(yōu)質(zhì)、全mian、熱情的技術(shù)支持和產(chǎn)品服務(wù)。為了更好的方便客戶，與客戶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技術(shù)及儀器使用方面的經(jīng)驗(yàn)交流，特摘取專業(yè)文獻(xiàn)供用戶及廣大分析工作者參考交流。如客戶對(duì)儀器有特殊的改進(jìn)要求，請(qǐng)與我公司客服部聯(lián)系。 [摘要] 目的：為快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素殘留，建立了固相萃取 （SPE）－高效液相色譜（HPLC）分析法。方法：樣品高氯酸沉淀蛋白質(zhì)，超聲波提取，固相萃取，高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定4種抗生素。固相萃取小柱為ZORBAXSPE C18 Cart，洗脫液為50%甲醇水；色譜柱為SUPELCO Discovery C18 5μm250×4.6mm，流動(dòng)相為0.01mol/L 磷酸二氫鈉+0.001mol/L EDTA:甲醇=60:40（V／V，pH=2.0），流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為268nm。結(jié)果:本方法的檢出濃度分別為:土霉素（0.018 mg/kg）、四環(huán)素（0.025 mg/kg）、金霉素 （0.043 mg/kg）、氯霉素（0.010mg/kg）、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，其回歸方程及相關(guān)系數(shù)r分別為土霉素：Υ=56.3215x-0.9004，r=0.9999；四環(huán)素：Y=42.8345x-1.1484，r=0.9999；金霉素：Y=23.0097x-0.9630，r=0.9999；氯霉素：Y= 38.8332x+0.1655，r=0.9999，回收率在93%～101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.9%。結(jié)論:以超聲波萃取，經(jīng)固相柱凈化、用二極管陣列檢測(cè)器是一種快速、靈敏、簡(jiǎn)便的測(cè)定水產(chǎn)品中抗生素殘留的高效液相色譜方法。 隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，越來越多的抗生素被應(yīng)用于漁業(yè)生產(chǎn)中，這些藥物的使用幾乎貫穿養(yǎng)殖的全過程，由于養(yǎng)殖戶不遵守休藥期規(guī)定及未正確使用藥物，造成在水產(chǎn)品中的高水平殘留。人長(zhǎng)qi攝入含抗生素殘留的水產(chǎn)品后，藥物不斷在體內(nèi)蓄積，當(dāng)濃度達(dá)到一定量后，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性作用，四環(huán)素類藥物的毒性反應(yīng)主要表現(xiàn)為對(duì)胃、腸、肝臟的損害及牙齒的染色等。還會(huì)造成過敏反應(yīng)，二重感染，致畸胎作用。而氯霉素有嚴(yán)重的副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，對(duì)人類的健康構(gòu)成潛在的危害。因此，水產(chǎn)品中抗生素殘留量的檢測(cè)技術(shù)，日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本文研究了用固相萃�。⊿PE）－高效液相色譜法進(jìn)行4種抗生素的同時(shí)固相萃取和測(cè)定的*佳條件，結(jié)果令人滿意。現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下： 1 實(shí)驗(yàn)部分 1.1 儀器與試劑 HP1100型高效液相色譜儀，G1315A DAD 二極管陣列檢測(cè)器，G1313A ALS自動(dòng)進(jìn)樣器；SUPELCO DISCOVERY C185μm250×4.6mm色譜柱。固相萃取小柱為ZORBAX SPE C18Cart。12位固相萃取真空富集裝置，超聲波清洗器，超速離心機(jī)，攪肉機(jī)，漩渦混合器，甲醇（色譜純），磷酸二氫鈉（分析純），EDTA（分析純），高氯酸溶液（優(yōu)級(jí)純）、硝酸（優(yōu)級(jí)純）。土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（SIGMA公司）。 1.2 高效液相色譜分析條件 色譜柱為SUPELCO DISCOVERY C185μm250×4.6mm，流動(dòng)相為0.O1mol/L磷酸二氫鈉+0.001 mol/L EDTA:甲醇=60:40（V/V，pH=2.0），流速為0.8ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為268nm柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20μl。 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1 土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 分別稱取O.0100mg土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品置于4個(gè)1Oml容量瓶中，分別加入甲醇溶解并定容至刻度，此溶液濃度分別為1.00mg/ml，置于冰箱冷藏室保存。 1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制 分別吸取土霉素、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.00ml，金霉素、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各2.00m1．置于100ml容量瓶中，用流動(dòng)相A液定容至刻度，此溶液濃度分別為：土霉素（10μg/m1）、四環(huán)素（10μg/m1）、金霉素（20μg/m1）、氯霉素（20μg/m1），置于冰箱冷藏室保存。 1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制 準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml分別置于1Oml容量瓶中，用流動(dòng)相A液定容至刻度，得到的標(biāo)準(zhǔn)系列為：0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/m1（土霉素、四環(huán)素）；0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/m1（金霉素、氯霉素）。 1.3.4 流動(dòng)相A液的配制 0.01mol/L磷酸二氫鈉+0.001mol/L EDTA，用30%硝酸調(diào)至pH=2.0，經(jīng)0.45μm雙層水系濾膜過濾。 1.3.5 流動(dòng)相B液的配制 0.01mol/L磷酸二氫鈉，用30%硝酸調(diào)至pH=2.0，經(jīng)0.45μm雙層水系濾膜過濾。 1.3.6 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取5.00g攪碎的水產(chǎn)品于5Oml帶蓋的塑料離心管中，加入20%高氯酸溶液15ml，渦旋1min，將此離心管放入超聲波清洗器中提取20min后，用離心機(jī)離心10min，收集上清液于25ml容量瓶中，往殘?jiān)屑尤?Oml 2％高氯酸溶液，用玻棒攪動(dòng)使樣品均勻分散于高氯酸溶液中，將此離心管放入超聲波清洗器中提取20min后，用離心機(jī)離心10min，收集上清液于上述25ml容量瓶中，合并兩次上清液，用2%高氯酸溶液定容，取該提取液1O ml經(jīng)已調(diào)節(jié)的固相萃取小柱吸附，用10%甲醇水2ml沖洗固相萃取小柱，用50%甲醇水1ml洗脫后收集備用。 1.3.7 樣品測(cè)定 吸取樣品溶液20μl進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析，記錄四種抗生素的峰面積。根據(jù)4種抗生素的保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖定性，峰面積定量。 2 結(jié)果和討論 2.1 色譜分離條件的選擇 2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 由4種抗生素的紫外吸收光譜圖可見，土霉素、四環(huán)素、金霉素在268nm、355nm處各有1個(gè)吸收峰，氯霉素在278nm處有1個(gè)吸收峰，分別在波長(zhǎng)268nm、278nm和355nm下用高效液相色譜儀以4種抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明:在波長(zhǎng)268nm下4種抗生素色譜峰分離較好且測(cè)定靈敏度明顯高于278nm、355nm處，實(shí)際樣品在此波長(zhǎng)條件下的溶劑峰對(duì)4種抗生素的測(cè)定無影響，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為268nm。 2．1．2 流動(dòng)相的選擇 2.1.2.1 流動(dòng)相配比的選擇 為了有利于色譜峰的分離，選用0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液和甲醇的混合液為流動(dòng)相。分別進(jìn)行V磷酸二氫鈉：V甲醇=70：30、65：35、60：40、55：45的試驗(yàn)。由所得色譜圖及測(cè)定數(shù)據(jù)可以看出，隨著流動(dòng)相中甲醇含量的增加，4種抗生素測(cè)定的靈敏度升高，保留時(shí)間減少，但色譜峰分離變差。權(quán)衡分離度和保留時(shí)間，本方法選用V磷酸二氫鈉：V甲醇=60：40為流動(dòng)相。實(shí)際樣品在此流動(dòng)相條件下的雜質(zhì)峰對(duì)4種抗生素的測(cè)定無干擾。 2.1.2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 流動(dòng)相中0．001mol/LEDTA二鈉可以使分離效果更好。加入EDTA二鈉（A）和不加入EDTA二鈉的流相（B）測(cè)定的兩組數(shù)據(jù)比較見表1： 從表1中可見，流動(dòng)相中加入EDTA二鈉，提高了方法的精密度。原因是四環(huán)素類抗生素分子中含有酚羥基和烯醇基，易與二價(jià)金屬結(jié)合，因而造成重現(xiàn)性差，流動(dòng)相中加入適量EDTA二鈉可以改善這種現(xiàn)象。 2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇 2.2.1 樣品提取液的選擇 用高氯酸水溶液作為提取液是因?yàn)?種抗生素都能夠溶解于水，高氯酸可沉淀水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)。用魚肝樣品分別做濃度為0.1%、2%和5%高氯酸溶液的抗生素提取試驗(yàn)，隨著高氯酸濃度的增大，樣品中的蛋白質(zhì)沉淀更加完全，有利于提取液的過濾，但高氯酸濃度過大不僅會(huì)對(duì)溶液中的抗生素起一定的破壞作用，影響測(cè)定的靈敏度，而且也會(huì)造成試劑的浪費(fèi)，綜合考慮過濾的效果及測(cè)定的靈敏度，選取高氯酸濃度為2% 。 2.2.2 固相萃取條件的選擇 反相固相萃取程序：調(diào)節(jié)－上樣－沖洗－洗脫 調(diào)節(jié):在本研究中，先用2 ml甲醇沖洗固相萃取小柱，再用2ml水沖洗固相萃取小柱。 上樣:將樣品加到固相萃取小柱上。 沖洗:在本研究中，用10％甲醇水將干擾物沖洗下來。 洗脫:在本研究中，用50％甲醇水將4種抗生素洗脫下來，收集樣品用于分析。 固相萃取條件的選擇實(shí)際上是洗脫液的選擇:混標(biāo)中每種抗生素的濃度為0.5μg/ml。 洗脫液準(zhǔn)備：配制O%、10%、20%、30%……100%甲醇水 試驗(yàn)步驟:用11支固相萃取柱經(jīng)調(diào)節(jié)后，分別上樣1Oml上述混標(biāo)，分別用O%、10%、20%、30%……100%甲醇水各1ml洗脫，收集洗脫液，進(jìn)行HPLC測(cè)定，以各種抗生素的濃度為縱坐標(biāo)。甲醇水濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到固相萃取曲線，并計(jì)算*佳萃取條件下4種抗生素的固相萃取回收率。 試驗(yàn)結(jié)果：隨著洗脫液中甲醇含量的升高，土霉素、四環(huán)素的分離度明顯下降，各色譜峰的峰寬增大；另一方面，隨著洗脫液中甲醇含量的升高，洗脫液中4種抗生素的濃度急劇上升，用10%甲醇水洗脫時(shí)，洗脫液中四種抗生素的濃度為0，至50%甲醇水時(shí)，四種抗生素的濃度已達(dá)5.0μg/ml，而這時(shí)土霉素、四環(huán)素仍能夠很好分離，因此，選定*佳洗脫液為50%甲醇水，在此固相萃取條件下的固相萃取回收率分別為:土霉素100.6％、四環(huán)素99.2％、金霉素100.8％，氯霉素98.8％。固相萃取能將四種抗生素的檢測(cè)靈敏度提高l0倍左右，魚肝不經(jīng)固相萃取及經(jīng)固相萃取的樣品都作HPLC測(cè)定，兩者的HPLC譜圖比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過SPE萃取柱純化并濃縮的樣品，雜質(zhì)峰較少，土霉素峰清晰，并可看到四環(huán)素峰；而未經(jīng)固相萃取的樣品土霉素峰很低，雜質(zhì)峰多，檢測(cè)不到四環(huán)素。 2.3 方法的線性和檢出濃度 用土霉素、四環(huán)素濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/ml，金霉素、氯霉素濃度分別為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在規(guī)定的色譜條件下，進(jìn)樣20μl，進(jìn)行測(cè)定，求4種抗生素的響應(yīng)峰面積—濃度的線性回歸方程，其回歸方程及相關(guān)系數(shù)r分別為: 土霉素： Y=56.3215x-0.9004．r=0.9999； 四環(huán)素： Y=42.8345x-1.1484．r=0.99991 金霉素： Y=23.0097x-0.9630．r=0.9999； 氯霉素： Y=38.8332x+0.1655，r=0.9999。 表明在該濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，符合定量要求。 以基線噪音的3倍計(jì)算方法的檢出濃度，土霉素 （0.018 mg/kg）、四環(huán)素（0.025 mg/kg）、金霉素（0．043 mg/kg）、氯霉素（0.010mg/kg）。 2.4 方法的回收率和精密度 以空白魚肉樣品為本底，分別加入不同量的抗生素，測(cè)定方法的加標(biāo)回收率及精密度（每個(gè)樣品平行測(cè)定6次），結(jié)果見表2。 3 結(jié)論 通過高氯酸沉淀蛋白質(zhì)、超聲波提取樣品、固相萃取的前處理方法，以及優(yōu)化高效液相色譜條件下，成功地進(jìn)行了水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素四種抗生素殘留同時(shí)進(jìn)行固相萃取和高效液相色譜測(cè)定的方法研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該方法測(cè)定靈敏度高、穩(wěn)定性好、簡(jiǎn)便易行，四種被測(cè)組分色譜分離效果好。 注：本文摘自《現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)》 作者：羅曉燕，林玉娜，劉莉治 關(guān)鍵詞： 氮吹儀 固相萃取裝置 漩渦混合器 超聲波清洗器 固相萃取小柱 原創(chuàng)作者：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司 |
